使用原子力顯微鏡(AFM)觀察生化過程

　　隨著樣品處理技術(shù)在液體中成像技術(shù)的改善，應(yīng)用原子力顯微鏡（AFM）觀察復(fù)雜的生化過程成為可能。轉(zhuǎn)錄過程是基因表達(dá)的中心環(huán)節(jié)，而使用原子力顯微鏡（AFM）觀察蛋白質(zhì)和DNA的相互作用存在一個(gè)矛盾要解決：生物分子需要固定到基底上是原子力顯微鏡（AFM）的成像基礎(chǔ)，而生化反應(yīng)過程卻需要生物分子能相對自由地移動(dòng)。即使在大量非特異性DNA存在時(shí)，RNA聚合酶（RNAP）與啟動(dòng)子間仍存在很高的結(jié)合率，人們猜想RNAP沿著DNA的擴(kuò)散是其原因之一。非特異性復(fù)合物在適當(dāng)條件下沉積后，利用原子力顯微鏡（AFM）可觀察到RNAP沿著DNA滑動(dòng)，且能在不同的DNA片段間轉(zhuǎn)移。然而加入肝素可終止這些過程，這就進(jìn)一步證實(shí)了RNAP-DNA相互作用的非特異性。原子力顯微鏡（AFM）還能對轉(zhuǎn)錄的過程進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察，在加入核苷酸后，沉積到云母上的延長復(fù)合物沿著DNA模板單向移動(dòng)。兩個(gè)對照實(shí)驗(yàn)證實(shí)RNAP與DNA的相對移動(dòng)與轉(zhuǎn)錄的實(shí)際情況相符。在一個(gè)對照中，以沒有終止子的微環(huán)DNA作為模板，在云母上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在干燥后通過原子力顯微鏡（AFM）可觀察到合成的ＲＮＡ長鏈。在第二個(gè)對照中，DNA在相同的條件下，在云母上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。不同的是加入的核苷酸用32Ｐ標(biāo)記。

　　通過PAGE對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果顯示與云母結(jié)合的復(fù)合物具有活性，而且轉(zhuǎn)錄的速度與用原子力顯微鏡（AFM）測得的近似生物分子的構(gòu)象改變也是原子力顯微鏡（AFM）的重要觀察內(nèi)容。將尿素酶沉積到云母上并用原子力顯微鏡（AFM）掃描，在液池中加入尿素后發(fā)現(xiàn)，懸臂的垂直波動(dòng)明顯增加，這提示由酶活動(dòng)引起的構(gòu)象改變能直接通過原子力顯微鏡（AFM）記錄下來。格蘭陰性菌的外膜是其保護(hù)屏障，它由規(guī)則組裝的蛋白質(zhì)通道構(gòu)成。其中研究較多的是Deinococcusradiodurans的六角形組裝中間體（hexagonallypackedintermediate，HPI）蛋白。HPI被認(rèn)為與營養(yǎng)的攝入和代謝物的排出有關(guān)。HPI的原子力顯微鏡（AFM）圖像顯示了規(guī)則的六角形及中央的孔樣結(jié)構(gòu)。在液體中成像則發(fā)現(xiàn)HPI呈現(xiàn)出“開和“關(guān)”兩種不同的構(gòu)象。意義雖不清，但這卻顯示出原子力顯微鏡（AFM）在液體中成像的優(yōu)勢。

　　原子力顯微鏡（AFM）在研究分子識(shí)別中的應(yīng)用分子間的相互作用在生物學(xué)領(lǐng)域中相當(dāng)普遍，例如受體和配體的結(jié)合，抗原和抗體的結(jié)合，信息傳遞分子間的結(jié)合等，是生物體中信息傳遞的基礎(chǔ)。原子力顯微鏡（AFM）可作為一種力傳感器來研究分子間的相互作用。這是由于原子力顯微鏡（AFM）理論上能感應(yīng)10-14Ｎ的作用力，能感應(yīng)0.01ｎｍ的位移，而接觸面積可小到10ｎｍ2。因此，原子力顯微鏡（AFM）被用于研究互補(bǔ)的DNA鏈間、細(xì)胞粘附分子間及配體-受體間的相互作用力。生物素（biotin）和抗生物素蛋白鏈菌素（streptavidin）間有高親和力，其相互作用的熱力學(xué)數(shù)據(jù)也較為清楚。因而，生物素和抗生物素蛋白鏈菌素是原子力顯微鏡（AFM）測定特異相互作用力的良好典型。在一經(jīng)典實(shí)驗(yàn)中，用生物素化的小牛血清白蛋白（biotinlatedbovineserumalbumin，BBSA）包裹微球，而微球連在懸臂上形成BBSA功能化探針。然后在有生物素阻斷和無生物素阻斷的抗生物素蛋白鏈菌素溶液中測量BBSA功能化探針和BBSA包裹云母間的粘附力。

　　結(jié)果顯示，無生物素阻斷的抗生物素蛋白鏈菌素溶液中需要較大的力才能將BBSA功能化探針與云母表面分離，力的大小為（0.257±0.025）ｎＮ，與分離配體-受體所需的力相符。而在此基礎(chǔ)上可推算出其有效的斷裂距離為（0.95±0.10）ｎｍ。因此，當(dāng)針尖包裹了特定的分子（如生物素）后，通過針尖和樣品間的相互作用可用于辨認(rèn)表面的相應(yīng)分子（如抗生物素蛋白鏈菌素）的位置。現(xiàn)在已出現(xiàn)了商用的修飾探針，這些探針包裹了不同的分子，可用于不同用途的分子識(shí)別。因而原子力顯微鏡將發(fā)揮更廣泛的作用。原子力顯微鏡（AFM）在物質(zhì)超微結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用原子力顯微鏡（AFM）可以直接觀察到表面缺陷、表面重構(gòu)、表面吸附體的形態(tài)和位置、以及有表面吸附體引起的表面重構(gòu)等。原子力顯微鏡（AFM）可以觀察許多不同材料的原子級平坦結(jié)構(gòu)，例如，可以用原子力顯微鏡（AFM）對DL－亮氨酸晶體進(jìn)行研究，可觀察到表面晶體分子的有序排列，其晶格間距與X射線衍射數(shù)據(jù)相符。另外原子力顯微鏡（AFM）還成功地用于觀察吸附在基底上的有機(jī)分子和生物樣品，如，三梨酸、DNA和蛋白質(zhì)的表面。

　　海藻酸聚賴氨酸海藻酸（AlginatePolyL-LysineAlginate，簡稱APA）膠囊薄膜具有半滲透性，構(gòu)成可以阻止人體免疫系統(tǒng)的成分進(jìn)入由APA薄膜構(gòu)成的膠囊，從而使得膠囊內(nèi)的物質(zhì)免受免疫系統(tǒng)的侵害。因此，可采用該薄膜膠囊保護(hù)人體內(nèi)移植的組織，延長其在人體內(nèi)的存活時(shí)間。同時(shí)，對藥物具有緩釋效應(yīng)。APA薄膜的半滲透性同其表面的超微結(jié)構(gòu)有著密切的聯(lián)系，研究其表面的超微結(jié)構(gòu)對其半滲透性的研究具有重要的意義。已有文獻(xiàn)報(bào)道了關(guān)于采用原子力顯微鏡（AFM）對APA薄膜的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究的內(nèi)容，發(fā)現(xiàn)了APA表面的特殊結(jié)構(gòu)，從而揭示了APA表面超微結(jié)構(gòu)對半滲透性的重要意義。目前，利用原子力顯微鏡（AFM）已獲得了DNA、透析薄膜、烷烴分子、脂肪酸薄膜以及多糖等的超微結(jié)構(gòu)的圖象。