本文標題："古DNA或現(xiàn)代DNA序列測定時進行直接測序?qū)嶒?
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古DNA或現(xiàn)代DNA序列測定時進行直接測序?qū)嶒?/p>
除非有非常重要的理由需要克隆PCR產(chǎn)物，一般來說，PCR產(chǎn)物應(yīng)該直
接測序。克隆是從擴增產(chǎn)物中抽取單個的分子。這些單個的分子可能含有
錯誤的擴增及重組DNA片段(P~bo，1990；Handt efa／．，1994b；Golenbe
rg efa／．，1996)或者外源DNA的污染(Handtera／．，1994b；Krings ec
a／．，1997)。每一個克隆含有相同幾率的擴增誤差，因而，對序列變異
的最終了解決定于克隆取樣的多少和策略。根據(jù)是否為真實的序列的預(yù)先
假設(shè)而去掉一些克隆，而保留另外一些克隆的做法(Handt efa／．，1994b
~Krings efa／．，1997)，盡管有些偏頗，但是可以理解的，并且是合理
的。事實上，這個標準也適于在古DNA或現(xiàn)代DNA序列測定時進行直接測序
或克隆測序。擴增片段大小不對或明顯是錯誤基因的擴增產(chǎn)物通常被標記
為PCR誤擴增或假結(jié)果。另一方面，接受一些克隆，則問題更為復(fù)雜并有待
于合理的解釋。例如，假定大多數(shù)獲得的序列是真實的而小部分是污染的
序列就忽略了這樣一個事實，即已知的PCR產(chǎn)物的數(shù)量與污染程度、模板總
數(shù)以及與引物互補的特異序列之間差異有直接的聯(lián)系，而不是與實際的真
實性相關(guān)。直接對PCR產(chǎn)物進行測序基于這樣的認識，除非擴增錯誤是在起
始模板分子很少的首輪PCR循環(huán)中形成的，單個擴增錯誤在序列中是近乎隨
機的，并且在終產(chǎn)物中的頻率較小。由“jump PCR'’(門脅o efa／．，19
90)產(chǎn)生的拼合也是如此。因此，大多數(shù)的由多聚酶造成的錯誤可以檢測出
來，
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